上海蒲柘光电仪器有限公司

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单细胞显微工作站

  • 产品名称:显微单分子横向磁镊系统
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产品简介(与中科院物理所合作开发)

        通常的生物实验获得的信息几乎都是基于许多分子活动的平均结果(集群平均)。这类实验往往掩盖了各个分子的个性,也可能忽略掉短暂存在的中间过程。单分子实验能看到单个分子的确切表现,因此由单分子实验得到的信息将在单个分子层面进一步完善集群平均的实验结果。近二十多年来,物理学家发展出多种新型的观测和操控技术(如光镊,磁镊,原子力显微镜,单分子荧光等),将分子生物学与物理学的交叉领域推进到单分子水平。
        一方面,二十世纪五十年代DNA双螺旋结构的发现是生物物理学出现的一个历史性标志。DNA,又称脱氧核糖核酸,是细胞中遗传信息的载体。生物体内天然状态的DNA几乎都以B-DNA存在,即两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺旋的方式相互缠绕,两条多核苷酸链间以Watson-Crick原则互补配对,两个碱基对之间的距离为0.34nm。另一方面,细胞中无时无刻不在产生对细胞的生命活动中起着重要的调节作用的力,而DNA是重要的一种力的载体。因而了解DNA的力学性质有助于我们理解与之相关的生命过程的机理。
       本实验的目的是:通过用单分子磁镊测量Lambda DNA的拉伸曲线,初步了解单分子生物物理学;接触单分子技术中操作较为简单的磁镊装置;体验从样品池处理、反应底物连接、数据测量到数据处理的单分子生物物理实验的完整过程,认识DNA双螺旋结构的弹性性质,检验DNA双链的蠕虫链(Worm-like-chain,WLC)模型。

一、实验原理


1.DNA具有一定的弹性
        DNA具有弹性且DNA的弹性性质非常复杂。一方面,双链DNA的两条单链的相邻碱基具有一定的“碱基堆积力”和相邻磷酸负电性引起的力,使DNA碱基之间互相平行的空间关系更稳定,从而DNA倾向于直杆。另一方面,DNA所处环境中有KBT量级的热扰动,热扰动使DNA倾向于使DNA处于杂乱弯曲的状态,从而DNA倾向于团成小团。上述两个方面互相竞争,当用外力拉DNA的时候,DNA会更倾向形成直杆,显示为DNA两端的长度边长,这个现象说明DNA具有一定的弹性。
        定义DNA倾向于直杆的程度用一段长度描述,叫做“持久长度”,记作A。A的影响因素包括:DNA双链所在溶液的盐浓度、温度和DNA的GC丰富程度等。定义“沿着DNA的轮廓得到的长度”为“DNA的轮廓长度”,记作L0;而只考虑DNA的两个端点时,定义“DNA两个端点的长度”为“DNA的首末端距”,记作L。
2.DNA两端加力的方法
        本实验以外径1mm的方形毛细管为样品池,将毛细管内壁彻底清洗并硅烷化修饰,然后铺上地高辛抗体。Lambda DNA两端分别修饰上地高辛和生物素,修饰地高辛的一端可以通过抗原抗体相互作用连接在毛细管内壁,修饰生物素的一端以同样的原理连接在表面修饰了生物素抗体的超顺磁球表面,如图1所示。这样就可以用磁铁对超顺磁球施力,使DNA拉伸。
磁球所处的位置通过显微镜成像在感光元件CCD上。通过以灰度重心法为核心的程序实时计算球心的位置,即可得到每时每刻的ΔL值,如图1所示。
3.DNA双链的WLC模型
        在0.1-10pN的拉力范围内,描述双链DNA响应拉伸力的最好模型目前是WLC模型。根据该模型:

        其中KB是玻尔兹曼常量;T是热力学温度;L0是DNA的轮廓长度,Lambda DNA的L0约为16.4um;F为外力;L是DNA的首末端距;A为DNA的持久长度,在0.2mmol/L PB(磷酸盐换缓冲液)+140mmol/L NaCl溶液中,DNA的持久长度A为50nm左右。实验中只需测出不同F下对应的L值,即可作出F对L/L0的函数图。

 
 
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